實時熒光定量PCR系統(tǒng)實驗步驟

    1.設(shè)計實驗方案：例如對樣品、實驗組和對照組的一個實驗流程設(shè)計  

    2.引物和探針的設(shè)計和合成  

    3.抽提RNA，測定提取的RNA的濃度  

    4.反轉(zhuǎn)錄PCR  

    5.定量PCR  

    6.數(shù)據(jù)分析  

    在進行實時熒光定量PCR系統(tǒng)驗的過程中，PCR的擴增效率是一個非常重要的影響因素，因為定量PCR原理的理論方程是基于擴增效率zui大值1，因此高的擴增效率能保證定量PCR實驗的性及重復(fù)性，影響PCR擴增效率主要有以下幾個方面：1，擴增子的長度；2，擴增子的GC含量；3，擴增子、引物和探針的二級結(jié)構(gòu)；4，PCR反應(yīng)各組分的濃度；5，RNA或者cDNA的純度。  

    進行實時熒光定量PCR系統(tǒng)實驗時，必須設(shè)計好引物和探針，除了能獲得高的擴增效率外，對PCR擴增的特異性、消除基因組DNA的擴增及提高擴增的靈敏度都有很大的影響。下圖就是使用不同的引物和探針對18SRNA進行實時熒光定量PCR系統(tǒng)的熒光曲線圖（反應(yīng)條件和模板都相同）。